我们对1993年以来的12例同性恋感染者的血液样本进行了艾滋病病毒(HIV-1)亚型分析，以便了解北京市同性恋人群HIV-1的亚型分布、传播来源、流行时间和发展趋势。

1．材料与方法：

　　(1)研究对象及样本：所有研究对象的血液样本均来自北京市的HIV-1抗体阳性经同性恋途径感染者。每名对象首次就诊时采集5ml全血，使用Qiagen公司QiAampBlood试剂盒，按说明提取细胞DNA，核酸样本冻存于-20℃。

　　(2)聚合酶链反应(PCR)：采用套式PCR方法扩增HIV-1 env基因，引物设计参照文献。以ED3/ED14为外侧扩增引物进行第一轮PCR反应，条件为94℃ 2min，55℃ 1min，72℃ 3min，3个循环；94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 3min，32个循环；72℃延伸5min。以ED5/ED12为内侧引物进行第二轮PCR，条件为94℃ 2min，55℃ 1min，72℃ 3min，3个循环；94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 2min，32个循环；72℃延伸5min。

　　(3)DNA序列测定及系统树分析：①PCR产物的纯化：第二轮PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，与DNA标准分子量Marker对照判定无误后，切下特异扩增带，用Qiagen公司的Qiaex试剂，按说明提纯扩增的HIV-1 DNA片段。②DNA序列测定：以提纯的PCR产物为模板，用ABI公司荧光标记末段终止物循环测序试剂盒，在PE公司9600型PCR仪上进行测序反应，样本用量约1g，引物env D用量6ｐmol/L，反应产物经提纯后用ABI公司377型DNA序列测定仪进行序列测定。③系统树分析：测得的序列的同源性分析及亚型确定，使用PhyLip软件包完成。

2．结果：

　　应用巢式PCR方法从12例HIV-1阳性者外周血单核细胞(PBMC)样本中获得了可用于序列测定的HIV-1env目的基因片段，将这12个样本的核苷酸序列分别与国际标准的亚型(A～E)的核苷酸序列进行比较并用DistAnCE程序计算彼此间的基因离散率，结果发现12个样本与A、C、D、E亚型共享序列间的基因离散率均在25%以上，而与B亚型的共享序列间基因离散率仅为11.25%±3.6%，与流行于泰国B亚型的代表株TH14的基因离散率为17.44%±2.50%，而与流行于欧美B亚型代表株SF162的基因离散率仅为10.83%±4.53%，与其亚型内的基因离散率10.35%±2.06%十分接近。进一步的系统树分析显示，12个样本与B亚型共享序列聚在一起并远离其他国际亚型(图1)，并且12个毒株与SF162紧密相连而与国际B亚型共享序列和泰国B亚型代表株TH14可以分开，证明这12个样本确实为欧美B亚型。

图1　北京市12例同性恋人群HIV-1的系统树分析

3．讨论：

　　1981年在纽约、旧金山的同性恋群体中首先发现艾滋病，随后造成广泛流行，我国于1985年在来华旅游者中发现首例艾滋病后，1992年在同性恋群体中发现HIV-1感染者，现场流行病学调查显示，北京同性恋群体中的HIV-1感染者，有涉外同性恋史，本研究首次从分子流行病学角度加以证实。从我们对北京市1993年以来12份HIV-1阳性同性恋者PBMC样本的HIV-1前病毒DNA的C2～V3区序列进行分析后，发现这12份样本均为B亚型，且全部属欧美B亚型，而2例早期感染者的BJ01和BJ07与欧美B亚型代表株SF162的基因离散率仅为0.58%和0.83%，现场流行病学资料也显示这2例中的1例曾与瑞典人有同性恋关系，1例曾居住美国多年，这从两方面证实了北京市同性恋HIV-1感染来源确实为欧美传入。又HIV-1流行区毒株的基因离散率平均每年以0.5%～1%的速率增大，从北京市同性恋人群B亚型内的基因离散率可推断其流行时间已数年，这也与早期的现场流行病学调查结果一致。